Способи стерилізації рослинних експлантів
З метою отримання експлантів для калусних і пухлинної культур, мікроклонального розмноження, вивчення гормональної регуляції використовують стерильні проростки. Насіння для пророщування висівають або на воду, або на живильне середовище.
Рослинні об`єкти перед стерилізацією ретельно відмивають проточною водою, іноді з миючими засобами, очищають від зайвих тканин. З коренеплодів і коренів знімають шкірку, з пагонів - кору, з нирок - криють луски.
Рослинні експланти стерилізують розчинами речовин, що містять активний хлор (хлораміном, гіпохлоритом Са і Nа, сулемою), бром (бромной водою), перекисом водню, спиртом, нітратом срібла, діацідом, антибіотиками.
Етиловий спирт часто застосовують для попередньої стерилізації, протираючи їм поверхню матеріалу або занурюючи матеріал на кілька секунд в абсолютний спирт. Іноді такий стерилізації досить, її використовують при роботі з плодами, насінням, пагонами, зав`язі.
Гіпохлорит кальцію (хлорне вапно) використовується у вигляді 5-7% розчину для обробки нирок, зав`язей, квіток, насіння, пагонів протягом 5-8 хвилин.
Відео: Методи стерилізації та дезінфекції
Гіпохлорит натрію використовується у вигляді 0,5-5% розчину для обробки будь-яких експлантов протягом 1-20 хвилин. Ця речовина є клітинною отрутою, тому час стерилізації і концентрацію підбирають експериментально. Наприклад: для ізольованих зародків використовують 2-3% розчин протягом 10-15 хвилин, а для сухого насіння 3-5% розчин протягом 1 години. Залишки гіпохлориту натрію спочатку видаляють 0,01 н HCl, а потім 8 разів промивають автоклавуватися дистильованою водою.
Хлорамін застосовують в концентрації 1-6%. Пильовики і молоді зародки обробляють протягом 1-3 хвилин, сухе насіння - 30-60 хвилин, потім промивають стерильною дистильованою водою 2-3 рази.
Сулема - токсична речовина і вимагає особливої ретельності, як при зберіганні, так і при підборі концентрації для окремих об`єктів. Для стерилізації зародків використовують 0,1% розчин протягом 1-3 хвилин, для корені - і бульбоплодів - до 10-20 хвилин.
Розчини, що містять активний хлор використовуються 1 раз і готують їх безпосередньо перед роботою.
Діацід використовується в 0,2% розчині для стерилізації коренеплодів, насіння, шматочків, тканин, верхівкових меристем, ізольованих зародків, пиляків. Діацід готують, розчиняючи окремо 330 мг етанолмеркурхлоріда і 660 мг цетилпіридинію хлориду в гарячій воді (330 мл), потім їх змішують і доводять об`єм рідини до 1 л, додають кілька крапель детергента твін-80 зберігають в щільно закритій колбі в темряві.
Також застосовуються 5% -й розчин формаліну або фенолу. Антибіотики застосовують для стерилізації рослинного матеріалу, інфікованого бактеріями (тканини корончатогаллових пухлин). Часто застосовують стрептоміцин і тетраміцін 10-80 мг / л, ампіцилін 200-400 мг / л, левоміцетин, каноміцін і інші. Насіння можуть бути оброблені газами (оксид пропілену).
Стерилізацію можна розділити на три етапи:
- попередня стерилізація вихідного рослинного матеріалу. Умови обробки варіюють в залежності від об`єкта. Що зберігаються органи промивають водопровідною водою, фрагменти стебла, кореня або листа також промивають проточною водопровідною водою і поміщають в спирт. Попередня стерилізація насіння - триваліша процедура, що залежить від ступеня їх забрудненості.
Відео: Правильна стерилізація і дезінфекція інструментів в салоні Ля Руж
- власне стерилізація. Попередньо простерилізовані тканини і органи поміщають в стерилізує розчин. Необхідна умова процесу стерилізації - це забезпечення достатньою мірою чистоти об`єкта, і збереження його життєздатності.
- Постстерілізація. Відмивання об`єкта від стерилізуючого розчину порціями дистиляту.
