Ідентифікація вірусів бджіл методами молекулярно-генетичного аналізу

Відомо, що при одному і тому ж рівні зараження кліщами одні сім`ї бджіл гинуть, а інші залишаються живими. Пояснюється це тим, що при відсутності супутніх інфекцій бджоли можуть витримувати значний ступінь зараження кліщами - до 15 тис. Кліщів на сім`ю бджіл. У той же час досить 2 тис. Кліщів - переносників вірусу деформації крила, щоб сім`я бджіл загинула під час зимівлі. Для кожного конкретного вірусу або для комбінації вірусів кількість кліщів в сім`ї, при якому починається масова загибель бджіл, по-різному.

У колишні роки для виявлення вірусів бджіл використовувалися різні серологічні реакції, найчастіше реакція імунодифузії (РІД). В основі цієї реакції лежить взаємодія специфічних сироваток з антигенами шуканого вірусу. Недоліком РІД є її низька чутливість. Однак, якщо екстракт з загиблої бджоли в цій реакції позитивно реагує з певною сироваткою, можна сказати, що вірусу в екстракті дуже багато і що бджола загинула саме від цього вірусу.

В даний час зарубіжні дослідники для вивчення вірусів бджіл використовують сучасний, високочутливий метод ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції), що дозволяє виявляти віруси в дуже малих концентраціях, коли ніяких ознак захворювання у бджіл ще немає. Крім того, цей метод дає можливість виявляти відмінності між штамами вірусів на молекулярно-генетичному рівні. В ПЛР вірус виявляють за допомогою праймерів - невеликих ділянок геному вірусу. Ці ділянки містять всього 2-3 десятка нуклеотидів - незначну частину генетичної інформації вірусу, але вони повинні бути специфічні тільки для шуканого вірусу.

За допомогою методу ПЛР американські дослідники встановили, що в США практично всі бджолині сім`ї, які загинули від так званого колапсу в 2006-2007 рр., Були інфіковані ізраїльським вірусом гострого паралічу. Цей же вірус був виявлений у бджіл, що закуповуються Сполученими Штатами в Австралії. Для запобігання подальшого поширення вірусу на території США пропонувалося заборонити імпорт австралійських бджіл. Незважаючи на достовірне збіг випадків колапсу бджолиних сімей з наявністю ізраїльського вірусу гострого паралічу, виявилося все не так однозначно.

Подальші дослідження зразків зберігаються проб бджіл показали, що цей вірус циркулював на території США принаймні з 2002 р, тобто до початку масового завезення бджіл з Австралії. Були виявлені суттєві відмінності американських штамів вірусу від австралійських на молекулярно-генетичному рівні і показано, що ізраїльський вірус гострого паралічу має три різновиди. Крім того, було висловлено припущення, що ці різновиди, подібно вірусу грипу, здатні до рекомбінації і зміни своєї вірулентності [5].

Інтенсивні вірусологічні дослідження бджіл за допомогою методів молекулярно-генетичного аналізу проводяться і в багатьох європейських країнах, в тому числі там, де відзначається загибель бджолиних сімей з ознаками колапсу. Наприклад, в Австрії були досліджені зразки бджіл більш ніж 90 пасік. Проби брали з неблагополучних сімей з ознаками ослаблення, колапсу, паралічу бджіл і т.д. У більшості зразків було ідентифіковано більш одного вірусу. Найбільш поширеними виявилися вірус деформації крила (91% зразків), звичайний вірус гострого паралічу (68%) і вірус мішечкуватого розплоду (49%). У сім`ях, які загинули від раптового колапсу, найбільш часто вдавалося ідентифікувати одночасно вірус деформації крила і звичайний вірус гострого паралічу [2]. Інші європейські дослідники також найчастіше вказують на ці віруси як на можливу причину втрат бджолиних сімей.

Пізніше було встановлено, що якщо вірусологічні дослідження проводити з використанням методу ПЛР, то вірус деформації крила можна виявити практично на всіх пасіках США.

У Франції були проведені аналогічні дослідження зразків бджіл з пасік, які зазнали великих втрат в зимовий сезон 2007/08 р У зразках був ідентифікований ізраїльський вірус гострого паралічу, але він не був домінуючим (всього 14%), тоді як звичайний вірус гострого паралічу був встановлений в 40% зразків.

Дослідження молекулярно-генетичних особливостей вірусів виявило, що за первинну структуру деяких маркерних областей геному ізраїльський вірус гострого паралічу найбільш близький Кашмір-вірусу бджіл і звичайного вірусу гострого паралічу. Тому на перших етапах досліджень деякі фахівці, які брали праймери, які не специфічні для цих вірусів (тобто підібрані до однакових ділянках геномів цих вірусів), робили неправильні висновки про наявність того чи іншого вірусу в досліджуваному матеріалі. Особливо велика плутанина виникла між Кашмір-вірусом і ізраїльським вірусом гострого паралічу.

Було показано, що деякі ділянки геному ізраїльського вірусу гострого паралічу та інших вірусів інтегруються в геном бджіл. Фрагменти нуклеїнових кислот різних вірусів були виявлені в геномі бджіл приблизно 30% досліджених популяцій. Інтеграція вірусу в геном господаря - медоносної бджоли - має велике біологічне значення. Організм бджіл стає несприйнятливим до ізраїльського вірусу гострого паралічу, коли в їх геном інтегрований ділянку генома цього вірусу [4].

Нещодавно було показано, що фрагменти геному ізраїльського вірусу гострого паралічу і, можливо, вірусу деформації крила, інтегровані в геном бджоли, можуть бути стабілізовані, стають спадковим ознакою і передаються потомству. Бджола, яка ніколи не контактувала безпосередньо з вірусом, може бути діагностована за результатами ПЛР як заражена, тоді як вона успадкувала вірусний сегмент від прародителя [3]. Тому для виключення хибнопозитивних відповідей необхідно проведення спеціальних досліджень.

Повідомлення про виявлення деяких вірусів бджіл практично на всіх досліджуваних пасіках, мабуть, можуть не відповідати дійсності. Виявлення за допомогою ПЛР ділянок геному деяких вірусів зовсім необов`язково говорить про присутність безпосередньо вірусів і тим більше про загибель від них бджіл. У деяких випадках це може, навпаки, служити свідченням стійкості даної популяції бджіл до даного вірусу.

Таким чином, за допомогою методів молекулярно-генетичного аналізу за останні роки отримана маса нової інформації по вірусам бджіл і поставлено багато питань, в тому числі що стосуються інтерпретації отриманих результатів. У яких випадках можна вважати встановленим факт загибелі бджіл від вірусу? В яких це всього лише вірусоносійство, а причини загибелі бджіл інші? В яких випадках вірусу взагалі немає, а є лише фрагменти вірусної генетичної інформації, вбудовані в геном бджоли?

Відео: Kent Hovind - Seminar 4 - Lies in the textbooks [MULTISUBS]

Нами було проведено дослідження патологічного матеріалу (загиблих бджіл і личинок) з пасік країни за допомогою методу ПЛР зі зворотною транскрипцією і зіставлення отриманих даних з результатами реакції імунодифузії. Ми провели ідентифікацію вірусів мішечкуватого розплоду, звичайного гострого паралічу і деформації крила. Для ідентифікації методом ПЛР вірусу мішечкуватого розплоду використовували личинок, які загинули від цього вірусу. Личинки, відібрані з хворої сім`ї бджіл (Московська обл.), Містили велику кількість вірусу, легко виявляється в РІД. Для ідентифікації методом ПЛР вірусу гострого паралічу використовували дорослих бджіл, заражених цим вірусом в лабораторних умовах, а також дві проби загиблих лялечок з хворих сімей бджіл, доставлених з Краснодарського краю і Оренбурзької області (наявність вірусу гострого паралічу в них встановлено за допомогою РІД). Для ідентифікації вірусу деформації крила використовували бджіл з родини (Московська обл.), В якій раніше цей вірус був виявлений за допомогою РІД.

Ідентифікація вірусів проводилась методом ПЛР зі зворотною транскрипцією за умовами, описаним раніше Tentcheva et al., [6] - Berenyi et al., [2]. ПЛР-продукти специфічного розміру були отримані для вірусу мішечкуватого розплоду, всіх зразків вірусу гострого паралічу і вірусу деформації крила при проведенні реакції за умовами [6]. Нам вдалося отримати ПЛР-продукт специфічного розміру тільки для вірусу деформації крила при проведенні реакції за умовами [2]. Визначення послідовності нуклеотидів досліджуваної області генома вірусу деформації крила і вірусу гострого паралічу і аналіз отриманих послідовностей виявили гомологію досліджуваних послідовностей з послідовностями цих вірусів, розміщених в міжнародній базі даних. Отримані результати однозначно підтверджують достовірність результатів молекулярно-генетичного аналізу. Відсутність продуктів ампліфікації для зразків, що містять вірус гострого паралічу, в разі проведення реакції за умовами [2] вимагає спеціальної уваги. Відомо, що для вірусів характерна варіабельність генома і цілком можливо, що відсутність позитивної реакції пов`язане з поширенням на території Росії специфічних штамів вірусу гострого паралічу бджіл.

Таким чином, використання молекулярно-генетичних методів аналізу для виявлення вірусів бджіл, а тим більше інтерпретація результатів вимагають обережності. Необхідно вивчити штами вірусів, що циркулюють на території Росії на молекулярно-генетичному рівні в поєднанні з уже відпрацьованими серологічними методами діагностики. Важливо визначити у бджіл не тільки наявність генетичної інформації вірусів, але і присутність самих віріонів, а також їх кількісний вміст.

Молекулярно-генетичні дослідження дадуть в майбутньому можливість оцінити поширеність вірусів в популяціях бджіл Росії, в тому числі не виявлених раніше вірусів і їх різновидів. Отримані дані закладуть основу для розуміння і прогнозування розвитку ситуації в конкретному регіоні в зв`язку з наявністю того чи іншого вірусу або їх комбінацій, дозволять проводити аналізи для потреб практичного бджільництва, оцінювати можливість переходу за певних умов прихованої інфекції у відкрите захворювання з важкими наслідками.

Робота підтримана грантом Президента РФ НШ-4442.2010.4 і грантом підпрограми «Генофонди і генетичну різноманітність» програми Президії РАН «Біологічне різноманіття».

ГНУ ВНДІ експериментальної ветеринарії
ім. Я.Р.Коваленко

Державна установа
«Інститут загальної генетики
ім. М.І.Вавілова РАН »

Ключові слова:
віруси бджіл, варроа, ізраїльський вірус гострого паралічу, Кашмір-вірус.

Відео: Комп`ютерний вірус # 39; картоха # 39;

анотація:
показані результати молекулярно-генетичні досліджень. Вони дадуть в майбутньому можливість оцінити поширеність вірусів в популяціях бджіл Росії, в тому числі не виявлених раніше вірусів і їх різновидів.

Summary:
shows the results of molecular genetic studies. They will in the future to assess the prevalence of viruses in bee populations in Russia, including those not previously identified viruses and their varieties.

Keywords:
virus of bees, Varroa, an Israeli virus, Kashmir-virus.

література:
1. Батуев Ю.М. Нове про вірус паралічу // Бджільництво. - 1979. - №7. - С. 10-11.
2. Berenyi O., Bakonyi T., Derakhshifar I. et al. Occurrence of Six Honeybee Viruses in Diseased Austrian Apiaries // Applied and Environmental Microbiology. - 2006, vol. 72, 4, 2414-2420.
3. Maori E., Mozes-Koch R., Sela I. Integration of viral sequences into the bee genome: how to distinguish between viral infection and expression of integrated sequences // COLOSS Work Shop New Molecular Tools - Bern, Switzerland, 12- 21 May 2009 p. 20.
4. Maori E., Tanne E., Sela I. Reciprocal sequence exchange between nonretro viruses and hosts leading to the appearance of new host phenotypes // Virology, 2007, 362 (2), 342-349.
5. Palacios G., Hui J., Quan P.L. Genetic Analysis of Israel Acute Paralysis Virus: Distinct Clusters are Circulating in the United States // Journal of Virology, 2008, Vol. 82, No. 13, p. 6209-6217.
6. Tentcheva D., Gauthier L., Zappulla N. et al. Prevalence and Seasonal Variations of Six Bee Viruses in Apis mellifera L. and Varroa destructor Mite Populations in France // Applied and Environmental Microbiology. - 2004, 70, 12, p. 7185-7191.

Поділися в соц мережах: