Молекулярна діагностика нозематозу

Відео: ТК «Росія 1» про конференцію «Молекулярна діагностика - 2017»

Нозематоз - небезпечне захворювання медоносної бджоли, широко поширене у всьому світі і періодично викликає масову загибель бджіл і бджолиних сімей на пасіках (Трун і ін., 1987 Bourgeois et al., 2009). Збудник нозематозу медоносних бджіл мікроспоридій Nosema apis був описаний 100 років тому (Zander, 1909) і до останнього часу вважався єдиним специфічним паразитом медоносної бджоли Apis mellifera. У 1997 р був описаний новий збудник нозематозу - Nosema ceranae, виділений з далекосхідної бджоли Apis cerana, який в останнє десятиліття реєструється в пробах медоносної бджоли, зібраних з більшості континентів (Klee et al., 2007). Патогенний вплив на бджіл у N. ceranae виражено значно сильніше в порівнянні з N. apis, хоча класичними методами мікроскопічної діагностики паразити цих двох видів погано помітні і вимагають аналізу тонкої морфології або нуклеотиднихпослідовностей РДНК (Bourgeois et al., 2009). За деякими даними, можливе зараження медоносної бджоли і паразитом джмелів - Nosema bombi, що викликає дисемінований мікроспорідіоз, а також іншими формами микроспоридий, видова приналежність яких не визначена - Nosema sp. і Microsporidium sp. (Трун і ін., 1987). Філогенетичний аналіз, заснований на аналізі нуклеотидних послідовностей ДНК, що кодують рибосомальної РНК (РДНК), припускає походження обох видів микроспоридий - специфічних паразитів бджіл - від паразита джмелів (Shafer et al., 2009).

В даний час за кордоном рутинне визначення видів збудників нозематозу бджіл проводиться на основі секвенування або видоспецифической ампліфікації ділянок РДНК микроспоридий. У Росії нозематоз діагностують тільки мікроскопічним методом, при якому неможливо встановити видовий склад збудників захворювання. При виявленні ноземаподобних суперечка методом світлової мікроскопії патоген зазвичай визначається як N. apis. Наш досвід показує, що на пасіках Росії бджолярі виявляють нозематоз за клінічними ознаками (весняна опоношенность гнізда, ослаблення сімей, загибель матки та ін.). Однак попередній діагноз не завжди підтверджується лабораторними дослідженнями, оскільки такі симптоми характерні і для бактеріальних кишкових інфекцій медоносних бджіл. У той же час при латентному перебігу захворювання або низького ступеня ураження збудником нозематозу бджіл мікроскопічні дослідження їх проб не завжди показують присутність спор ноземи, що створює загрозу неконтрольованого поширення захворювання між окремими родинами та пасіками.

Таким чином, застосування сучасних методів молекулярно-біологічного аналізу необхідно як для видової ідентифікації патогенів, так і для підвищення чутливості діагностики нозематозу бджіл.

Спори микроспоридий отримані в такий спосіб. На початку червня на приватну пасіку (с. Дубровно, Ярковській р-н, Тюменська обл.) Завезли пакети бджіл з Пермського краю. Сім`ї з пакетів добре розвивалися, але через три тижні почалося їхнє різке ослаблення і загибель бджіл. Мікроскопічний аналіз показав високий ступінь зараження ноземи - 170-200 суперечка в поле зору (що відповідає близько 400 млн суперечка на бджолу). Розвиток захворювання могло бути пов`язано як з інтродукцією збудника з Пермського краю, так і з сприйнятливістю завезених бджіл до місцевих (Тюменський) ізолятів патогена. У зв`язку з такою невизначеністю географічного походження отриманий ізолят позначений нами як «Тюменський», за місцем його виділення.

Спори, виділені із загиблих бджіл, згодовували з цукровим сиропом з метою масової їх напрацювання для молекулярно-біологічного аналізу. Потім суперечки виділяли методом гомогенізації і осадження.

Для визначення придатності умов зберігання зразків бджіл для їх ПЛР-аналізу водну суспензію суперечка розділили на аліквоти по 100 мкл. У кожному варіанті зберігання використовували дві повторності. Варіанти консервації суперечка були наступними: водна суспензія, 8 ° С водна суспензія, -20 ° С суспензія в 50% -ному гліцерині, -20 ° С водна суспензія, -80 ° С спори, висушені і зберігалися при кімнатній температурі - фіксація 70 ° -ним і 90 ° -ним етанолом при кімнатній температурі. Всі зразки зберігали в зазначених умовах протягом місяця.

Для екстракції геномної ДНК зразки інкубували 3 ч при 65 ° С в лізуючого буфері, що містить цетилтриметиламоній бромід (ЦТАБ), протеїназу До і b-меркаптоетанол з подальшим очищенням сумішшю фенолу і хлороформу і осадженням ізопропанолом (Sambrook et al., 1989). Цей метод більш трудомісткий, ніж сучасні комерційні набори для виділення нуклеїнових кислот, але зате він дає бóльшій вихід геномної ДНК, що принципово важливо при її низькому вмісті в зразку (Stone et al., 2004).

Для проведення полімеразної ланцюгової реакції використовували стандартні умови, підібрані раніше (Ігнатьєва і ін., 2008 Токарев і ін., 2009). В якості маркерів ділянок ДНК, що кодують рибосомальної РНК, використовували праймери, рекомендовані для більшості микроспоридий і показали свою ефективність для діагностики ряду микроспоридий комах (Weiss, Vossbrinck, 1999). Для оцінки результатів ПЛР продукти реакції розділяли методом електрофорезу в агарозному гелі з додаванням бромистого етидія, який зв`язується з молекулами нуклеїнових кислот і дає флюоресцентні світіння під дією ультрафіолету. Позитивний сигнал, тобто забарвлені смуги певного розміру, спостерігали при широкому діапазоні температури відпалу праймерів, що свідчить про відтворюваності результатів ПЛР-діагностики при варіюванні умов її проведення. При цьому використання пари праймерів V1f: 530r дозволяло спостерігати позитивний сигнал у варіанті розведення зразка, що відповідає кількості ДНК, виділеного з 10-15 суперечка. Така висока чутливість діагностики відтворювалася по відношенню до всіх варіантів зберігання зразків суперечка микроспоридий, включаючи висушування і заморожування. Отже, апробовані умови зберігання зразків микроспоридий не впливають на ефективність подальшої ПЛР-діагностики, що, очевидно, обумовлено високою стабільністю структури молекул ДНК (Stone et al., 2004).

Відео: CMD Центр молекулярної діагностики

Для визначення видової приналежності виявленого паразита специфічний фрагмент ДНК, ампліфікований в результаті ПЛР, було виділено з агарозного гелю методом сорбирования на силікагелі і секвенирован на автоматичному секвенатор. Отримана нуклеотидних послідовність (сиквенс) з 411 нуклеотидів була відредагована в додатку BioEdit (Hall, 1999) і порівняна з сиквенс рибосомальной ДНК микроспоридий, доступними в Генбанка на сервері NCBI (ncbi.nlm.nih.gov). Подібність нуклеотидних послідовностей тюменського ізоляту микроспоридий і різних ізолятів N. apis склало 99,7-100%. Рівень подібності отриманого сиквенсу з сиквенс РДНК N. bombi і N. ceranae був значно нижче (90,2 і 87,7% відповідно), що дозволяє однозначно ідентифікувати тюменську мікроспоридій як N. apis. При цьому у тюменського ізоляту спостерігалося 100% -ве схожість даної ділянки РДНК з ізолятів N. apis з Нової Зеландії і відміну на один нуклеотид в положенні 45 від ізолятів з Іспанії, Швеції та США. У перерахованих ізолятів N. apis, представлених в Генбанка, ділянки РДНК не мають інших відмінностей в області, що кодує рРНК малої субодиниці. Для подальших філогеографіческіх досліджень (тобто аналізу еволюційних зв`язків між географічними ізолятів) необхідно секвенування міжгенних транскрібіруемих спейсера (ITS) і РДНК великої субодиниці (Rice, 2001), що вимагає застосування інших наборів праймерів (Weiss, Vossbrinck, 1999).

ПЛР може бути рекомендований як швидкий, надійний і високоефективний метод діагностики нозематозу медоносної бджоли. Наявність у вільному доступі інформації про нуклеотидних послідовності ДНК микроспоридий різних видів, що паразитують в бджолиних, дає можливість розробки видоспецифічності праймерів, які в подальшому дозволять проводити видову ідентифікацію патогенів на основі ПЛР без звернення до більш трудомістким і дорогим методам секвенування.

Відео: Франшиза Центру молекулярної діагностики (CMD)

Дослідження підтримані грантом РФФД №07-04-00269 і грантом Президента РФ № МК-3419.2009.4.

Ю.С.ТОКАРЕВ, А.Н.ІГНАТЬЕВА
З.Я.ЗІНАТУЛЛІНА

Всеросійський НДІ захисту рослин РАСГН,
Всеросійський НДІ ветеринарної ентомології
і арахнології СО РАСГН

Ключові слова:
нозематоз, мікроспоридії, ПЛР-діагностика, РДНК.

анотація:
аналіз нуклеотидної послідовності ділянки рибосомальной ДНК дозволив ідентифікувати вид збудника захворювання як Nosema apis. ПЛР може бути рекомендований як швидкий, надійний і високоефективний метод діагностики микроспоридий медоносної бджоли.

Summary:
analysis of the nucleotide sequence of the site of ribosomal DNA allowed to identify the type of pathogen diseases such as Nosema apis. PCR can be recommended as a fast, reliable and highly effective method for diagnosis of microsporidia honeybee.

Keywords:
nosema, microsporidia, PCR diagnostics, rDNA.

література:
1. Трун О.Ф., Смирнов А.М., Попов Е.Т. Хвороби і шкідники медоносних бджіл: довідник. - М .: Агропромиздат, 1987.
2. Ігнатьєва О.М., Токарев Ю.С., Горбунов П.С. Молекулярна діагностика мікроспоридії Nosema sp. (Microsporidia, Nosematidae) - паразита медоносної бджоли Apis mellifera L. // Наук. тр. каф. зоол. РГПУ. - 2008. - №8. - С. 50-54.
3. Bourgeois A.L., Rinderer T.E., Beaman L.D., Danka R.G. Genetic detection and quantification of Nosema apis and N. ceranae in the honey bee // J. Invertebr. Pathol. - 2009. - in press.
4. Shafer A.B., Williams G.R., Shutler D., Rogers R.E., Stewart D.T. Cophylogeny of Nosema (Microsporidia: Nosematidae) and bees (Hymenoptera: Apidae) suggests both cospeciation and a host-switch. J. Parasitol. - 2009. - Vol. 95. - P. 198-203.
5. Zander E. Tierische Parasiten als Krankheitserreger bei der Biene // Leipziger Bienenztg. - 1909. - Vol. 24. - P. 147-150.

Поділися в соц мережах:

Увага, тільки СЬОГОДНІ!

Схожі