Методи ідентифікації підвиду бджоли медоносної (apis m. Mellifera l.)

бджолиПриродний ареал Apis mellifera L. охоплює всю Африку, Європу і Близький Схід. Відмітна риса виду - значна внутрішньовидова диференціація (Ruttner, 1988). На даний момент загальновизнано існування 25 підвидів. На території Європи відомі дев`ять, вісім з яких мешкають в Південній і Центральній Європі, і тільки один підвид, Apis mellifera mellifera L. (темна європейська, темна лісова, вона ж среднерусская бджола), освоїв лісостепову і лісову зони Північної Європи, що робить його дуже цінним для бджільництва північних країн.

На жаль, в результаті безперервного ввезення бджіл з півдня в більш північні регіони сталася масова гібридизація аборигенних бджіл. У Німеччині масове ввезення A. m. carnica в 40-х роках XIX ст. привів майже до повної заміни місцевих бджіл A. m. mellifera (Maul, Hahnle, 1994). Аналогічне сталося і на більшій частині території скандинавських країн і Британських островів, де зараз розводять A. m. ligustica і A. m. carnica (Cooper 1986- Dews, Milner 1991- Jensen, 2005). Така ж ситуація склалася і в Росії.

Одне з основних умов збереження генофонду - його чітка ідентифікація (Daly, 1991), яка тим точніше, чим здійснено інструмент (метод) її проведення. Спочатку аналізували тільки морфометрические ознаки. Так, Г.А.Кожевніков (1900) зробив заміри довжини хоботка бджоли і запропонував методику вимірювання її хітинових частин. Сучасна морфометрична класифікація A. mellifera грунтується на роботах G.Goetze (1940), В.В.Алпатова (1948) і F.Ruttner et al. (1978). F.Ruttner (1988, 1992), використовуючи Мультиваріантний аналіз морфометричних ознак, розробив метод отличения A. m. mellifera від інших європейських підвидів, проте не зміг знайти чітких морфометрических відмінностей між A. m. iberica і A. m. mellifera. Н.І.Крівцов (1998) в своїй роботі представив стандарти розмірів частин тіла для підвиду A. m. mellifera, використовуючи які, можна досить точно визначити підвидового приналежність. Морфометрические стандарти отримані і в нашій лабораторії для підвиду A. m. mellifera башкирських бджіл (Саттаров, Ніколенко, 2002). Однак з`ясувалося, що ці методи часто не дозволяють точно ідентифікувати підвиди через сильну залежність морфометричних характеристик бджіл від умов навколишнього середовища і рівня внутрішньовидової гібридизації (Guzman-Novoa et al., 1994).

В даний час більшість дослідників стало переходити на використання молекулярних маркерів, що дають однозначно інтерпретуються результати. У 60-х роках минулого століття дослідження популяцій проводили за даними аналізу поліморфізму ізоферментів (аллозімов) (Hunter, Market, 1957- Richardson et al., 1986, Behura, 2006). На жаль, цей метод не отримав широкого застосування через низький рівень поліморфізму у Hymenoptera (Badino et al., 1982- Sheppard, 1988), і зокрема у медоносної бджоли (Sheppard, Berlocher, 1984 Sheppard, 1988). Так, гетерозиготность (H) аллозімов у бджіл в середньому дорівнює 0,01 (Pamilo et al., 1978), тоді як у більшості представників інших загонів комах цей показник в середньому становить близько 0,1 (Lewontin, 1974). Також відомо, що з 23 проаналізованих ферментних систем поліморфними виявилися тільки дві у бджіл європейських популяцій (Shep-pard, Berlocher, 1984), а з 25 - тільки три у бджіл башкирської популяції A. m. mellifera (Косарев з співавт., 2000).

Відео: Apis mellifera carnica. Бджола Карника. Проточна Поїлка для Бджіл з Підігрівом. Сонячний колектор

Розробка полімеразної ланцюгової реакції (PCR) в 80-х роках (Mullis et al., 1994) зробила можливим вивчення поліморфізму ДНК і привела до революції в галузі молекулярної біології. Основна ідея PCR полягає в багаторазовому збільшенні (ампліфікації) певного фрагмента ДНК з використанням праймерів, що обмежують цей фрагмент, що дозволяє проводити аналіз, користуючись мінімальним числом біологічного матеріалу. Надалі на основі PCR з`явилося безліч молекулярних методів дослідження.



Вперше в бджільництві ДНК-маркери застосували при вивченні поліморфізму довжин фрагментів рестрикції ДНК (RFLP) з використанням ендонуклеаз (рестриктаз). D.R.Smith, W.M.Brown (1988) показали відміну підвиду A. m. mellifera від Афріканізірованние бджіл в США методом RFLP мтДНК ендонуклеаза BcII, EcoRI, NdeI, XbaI. Недолік цього методу - необхідність великої кількості ДНК. Надалі в розрізненні підвиду A. m. mellifera стали використовувати модифікований варіант RFLP, заснований на рестрикції ампліфикувати фрагментів ДНК. H.G.Hall, D.R.Smith (1991) на основі RFLP ампліфикувати фрагментів генів COI і COII ендонуклеаза EcoRI, HincII, XbaI показали відмінності підвиду A. m. mellifera від інших підвидів в Іспанії. На основі RFLP амплифицированного фрагмента міжгенних локусу COI-COII мтДНК з використанням ендонуклеази DraI встановили відмінності підвиду A. m. mel-lifera від представників підвидів інших еволюційних гілок на території Франції (Franck et al., 1998), Італії (Franck et al., 2000), Норвегії, Швеції, Данії, Шотландії, Англії, Ірландії (Jensen et al., 2005) .

Паралельно з методом RFLP ДНК розвивався і метод вивчення поліморфізму довжин ампліфикувати фрагментів зі випадково обраними праймерами (RAPD). У методі RAPD використовують зазвичай один праймер, який може ампліфікувати фрагменти ДНК з будь-яких локусів генома, тобто цей метод не є сайт-специфічним. Метод RAPD знайшов застосування в дослідженнях генома медоносної бджоли (Чудінов, 1999), проведенні генетичної паспортизації декількох підвидів бджіл, а також в ідентифікації підвидів A. m. mellifera і A. m. caucasica на основі праймерів OPA-01 і OPA-04.

Ще один метод ідентифікації - аллель-специфічна PCR з використанням пари праймерів, що обмежують ампліфіціруемого фрагмент. В Інституті біохімії і генетики Уфимського наукового центру РАН співробітники розробили метод швидкої PCR-ідентифікації підвиду A. m. mellifera в Республіці Башкортостан на основі поліморфізму міжгенних локусу COI-COII мтДНК. Надалі наша лабораторія проводила пошук популяцій підвиду A. m. mellifera на території Республіки Башкортостан і Пермського краю (Південний і Середній Урал) на основі поліморфізму міжгенних локусу COI-COII мтДНК (Саттаров, Ніколенко, 2000- Ніколенко, Поскряков, 2002). В результаті виділили чотири популяції A. m. mellifera (Ільясов, 2005- Ільясов з співавт., 2006).

Методика розрізнення підвидів бджіл на основі поліморфізму мікросателітних локусів SSR також заснована на аллель-специфічної PCR. Микросателлитная локуси розташовуються по всьому геному і містять до 100 тандемних повторів розміром 2-10 п. Н. Багато тісно пов`язані з консервативними локусами (Loxdale, Lushai, 1998). Останнім часом поліморфізм мікросателітних локусів широко використовують у всьому світі для розрізнення підвидів бджіл. Розроблено кілька методів: A.Estoup et al. (1995) на основі поліморфізму 7 мікросателітних локусів (B124, A7, A24, A113, A28, A88, A43) і P.Franck et al. (1998, 2000) на основі поліморфізму 8 мікросателітних локусів - в Європі-P.De La Rua et al. (2002) на основі поліморфізму 8 мікросателітних локусів - в Північно-Східній Італії-A.Jensen et al. (2005) на основі поліморфізму 11 - в Норвегії, Швеції, Данії, Шотландії, Англії, Ірландії, а також в нашій лабораторії Р.А.Ільясовим (2006) на основі поліморфізму 2 мікросателітних локусів (Ap243, 4a110) на Південному і Середньому Уралі на території Республіки Башкортостан і Пермського краю.

Секвенування ДНК, тобто визначення її повної нуклеотидної послідовності, також часто використовуваний метод ідентифікації підвидів бджіл. J.-M.Cornuet et al. (1991) просеквеніровалі міжгенних локус COI-COII мтДНК бджіл і показали відмінності A. m. mellifera від інших підвидів. Після винаходу автоматичного секвенатор стало доступним дослідження великого числа зразків за порівняно короткий час. M.C.Arias, W.S.Shep-pard (1996) на основі секвенування фрагмента гена ND2 мтДНК показали відмінності A. m. mellifera від інших підвидів бджіл в Європі. У нашій лабораторії Р.А.Ільясов з співавторами (2006) на основі цього методу показали відмінності A. m. mellifera від південних підвидів бджіл на Уралі. Зовсім недавно співробітники консорціуму з секвенування генома бджоли просеквеніровалі весь геном медоносної бджоли і виділили відмінності між A. m. mellifera і іншими підвидами (Weinstock et al., 2006). Їм вдалося показати, що підвид A. m. iberica дуже схожий з A. m. mellifera і групується з ним. Такий стан може бути результатом гібридизації предкової форм іберійських бджіл, про що пишуть багато дослідників (De La Rua et al., 2002).

Відео: Пчели.Пчеловодство.Селекція медоносної бджоли

Таким чином, існує ряд методів ідентифікації підвиду A. m. mellifera (темної європейської, або темної лісової, або середньо бджоли). Як можна помітити, найбільш перспективний на сьогоднішній день - метод секвенування генома, а також методи, засновані на PCR. Наша лабораторія розробила комплекс методів для ідентифікації генофонду середньо бджоли і активно веде роботи з пошуку збережених популяцій A. m. mellifera на території всієї Росії і їх детальної генетичної характеристиці.

Робота виконана за підтримки гранту РФФД 06-04-08183-офі і 08-04-97039-р-поволжя-а.

Р.А.ІЛЬЯСОВ, А.В.ПОСКРЯКОВ, А.Г.НІКОЛЕНКО

Інститут біохімії і генетики Уфимського наукового центру РАН,
450054, м Уфа, пр. Жовтня, буд. 71

Поділися в соц мережах:


Увага, тільки СЬОГОДНІ!
Схожі
» » Методи ідентифікації підвиду бджоли медоносної (apis m. Mellifera l.)